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保兴发酵罐:发酵过程pH的调控方法浅析

时间: 2019-05-23来源: 作者:

微生物发酵是一个十分复杂的生物化学反应过程,由于生物体的生长、繁殖、代谢有许多不确定性,并受环境影响比较大,而微生物细胞内同时进行着成千上万种不同的生化反应,各有各的调控机制,相互促进相互制约,因此,其控制过程也比较难,只能依据宏观现象或借助一些检测手段来推测微观变化,而后施行进行人为干预,进而引导其朝着我们设定的方向发展。


通过取样分析获得与微生物发酵相关的参数包括:物理、化学、生物三类。(宏观现象不在本文赘述)。

1、物理参数包括:温度、罐压、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、发酵液粘度;

2、化学参数包括:酸碱度、基质浓度、溶解氧浓度、氧化还原电位、中间体物质浓度、产物浓度、比生产速率、尾气氧含量、尾气二氧化碳含量;

3、生物参数包括:菌体浓度、比生长速率、菌体形态;


各参数调控方式以及各参数之间错综复杂相互关系,今天不做展开,仅对pH值的进行详细分解。


第一部分 现行的pH控制理论


第一节 为什么要控制pH值?

1. 影响菌体生长:

每种微生物都有其适合生长的pH值范围,原因有二:

(1) 对营养成分的影响:不同的pH值条件下,培养基中各营养物质的稳定性不同;各营养物质之间发生化学反应不同;有机碳、氮源的水解或变性情况不同。进而影响菌体对营养物质的利用。

(2) 对菌体生物酶活性影响: 培养基中的H+或OH-直接影响胞外生物酶的活性,进而影响菌体生长。

(3) 对菌体细胞结构的影响。

(4) 对菌体细胞膜荷电影响:引起细胞膜的通透性发生改变,因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢物排泄。


2. 影响菌体代谢:

培养基中的H+、OH-首先作用在胞外的弱酸(或弱碱)上,使之成为易于透过细胞膜的分子状态的弱酸(弱碱),它们进入细胞后,再进行解离,产生H+或OH-离子,改变胞内原先的中性状态,影响酶的结构和活性。进而影响菌体代谢。


3. 影响产物稳定性:

不同的物质有不同的稳定pH值范围。特别是胞外表达的产物,直接裸露于培养液中,给予合适的pH条件至关重要。


4. 影响发酵液的后处理:

(1) pH值直接影响发酵液中某些物质的电荷性质

(2) pH值会影响发酵液的粘度。


第二节 是什么原因使pH值产生变化?


1. 培养基基质:

(1) 成分种类、含量及配比,分两种情况:

其一,成分本身的酸碱特性;

其二,成分经过菌体代谢后呈现出酸碱性:凡是代谢后产生酸性的物质,称为生理酸性物质;经代谢后产生碱性的物质,称为生理碱性物质。

生理酸性物质,如硫酸铵:菌体吸收其中的NH4作为氮源,残留的SO4与培养液中的H+结合成硫酸而使pH值降低。

生理碱性物质,如硝酸钠:菌体吸收其中的NO3-量远大于对Na 的吸收量,为保持体内电性平衡,细胞向外界分泌HCO3-或OH-,使溶液的pH值上升。

(2) 培养基灭菌:培养基中基质成分在高温高压状态下发生变化引起pH改变


2、 菌体生长不同阶段对pH影响不同:

(1) 菌体指数生长期:本阶段pH值迅速降低。

原因如下:

为满足菌体快速生长,大量营养物质被利用,打破原有体系的pH值体系平衡。

如:碳源代谢:无论是单糖、双糖、寡糖还是多糖,均先经水解为单糖再被利用,利用后产生有机酸,使pH值降低。


(1) 菌体生长平台期:菌体生长、衰亡趋于平衡。pH值基本呈下降,但趋势趋缓。若此时pH快速回升,说明碳源被利用完,菌体被迫利用胞内有机酸所致。

(2) 菌体衰亡期:由于菌体衰亡、自溶,pH值迅速回升。


注:若在菌体平台期、衰亡期出现pH值迅速下降状况,原因可能如下:

1) 传感器故障;

2) 染菌;

3) 补料时间过早,前期营养物质剩余;

4) 补料速率不合理,造成二次生长。


3、通气量及罐压

(1)通气量不足:

1)引起pH降低:厌氧发酵,产生大量乳酸pH值降低;另外,通气量流量小,产生的CO2不能及时随尾气排出,CO2溶于水中,使pH值降低;

2)引起pH值升高:氧气供应不足使菌体衰亡自溶,引起pH值升高。


(2)罐压太高:一般高于0.03Mpa

引起pH值降低:随着压力增高,CO2在水中溶解度增加,因此引起pH值降低。


第一节 发酵过程中pH值控制手段


1、 改变培养基中基质成分及比例:

每种微生物生长,以及目的产物的合成对营养物质的需求有一定的偏好性,因此可以利用来调控的空间不大。


2、 培养基中增加缓冲体系:

但需关注缓冲体系成分对菌体生长代谢的影响。


3、 培养过程中通过补加碳源来调节pH


4、培养过程中使用酸、碱进行调控:

常用酸如:盐酸、硫酸、醋酸、硝酸等;常用碱如:氢氧化钠、氨水等。


注意:

1)氨水可被作为氮源利用,因而打破营养物质的碳氮比平衡。

2)酸、碱调解过程,会造成培养液的局部过酸或过碱,从而引起局部菌体被灼伤、或代谢物被强酸、强碱破坏。

3)酸、碱调控,会改变培养液的离子强度。

第二部分 本人经验分享


第一节 发酵过程中pH值变化的本质


1、 pH变化的关键原因:除培养基基质成分、通气量和压力等理、化因素影响外,更多的是菌体生长代谢过程的生物因素。


2、 pH值检测方法:在线的pH电极即时测定;取样离线的pH计、pH试纸测定等。


3、 pH值变化的本质:

pH值测定方法可以看出,无论何种方法的测定值均代表的是菌体生物过程的结果,也就是说pH值测定永远滞后于菌体的生物过程。因此,pH值是菌体生物过程的结果。


第二节 基于pH值是生物过程的结果理论而形成的发酵过程中pH值控制原则和方法


既然pH值是生物过程的结果,那么一个发酵周期内菌体能够自然的达到理想的菌体生

长代谢所需的pH值才是“本”;而基于即时测定值而此进行的任何调控均是事后之事,谓之为“末”并不为过。常规的pH调控手段,往往掩盖了菌体生长、代谢的真实状态。因而为了控制pH值而控制pH即为“舍本逐末”。


1pH值的调控原则:

(1)以前馈作为调控节点;

(2)以顺势引导菌体生产、代谢过程为调控依据;

(3)以测定的pH值作为对调控手段有效性的检验。


2pH值的调控方法:把握前馈节点,控制菌体生长速度的方式,使发酵过程pH值在理想范围内。

(1)基础培养基配方:尽量避免缓冲体系;低浓度的碳、氮源,一般含量不超过1%;避免碳、氮源比例失衡(不同种类微生物、不同的代谢产物 所需碳氮比不同);

(2)补料培养基配方及补料速率:分三个阶段


第一阶段:指数生长期。

1) 补料配方:碳氮比宜高,且以速效碳、氮源为主;

2) 补料速率:控制比生长速率在30%左右,即可控制pH平缓下降。

生长速率太低生物量积累太少不利于产物表达。生长速率过高,菌体迅速进入衰亡期,pH值变化幅度过大、生产周期短,进而不利于产物积累。

3) 补料节点:以pH值比变化速率降低为补料节点(前馈点),可以有效的控制pH值变化,且不会造成营养过剩、或营养匮乏。


第二阶段:平台期(初级代谢产物开始积累)。

1) 补料配方:碳氮比缩小,增加迟效碳、氮源。

2) 补料速率:控制生物量基本保持不变,即可控制pH平稳。

3) 补料节点:以pH值比变化速率降低为补料节点(前馈点)。


第三阶段:衰亡期(次级代谢产物大量积累)

1) 补料配方:碳、氮源浓度仅维持菌体代谢即可。

若过高则造成菌体二次生长,使pH值下降。

2) 补料节点:以pH值比变化速率降低(缓慢回升过程)为补料节点,可维持pH值平稳。

 

总结:

发酵过程中的pH值变化是发酵过程状态体现、是生物生长代谢的结果。pH值不是发酵过程中需要控制的参数,而是发酵过程控制的依据和方向标。



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