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保兴生物:发酵工程师最值得收藏的文章

时间: 2019-11-25来源: 作者:

       众所周知,蛋白质结构复杂,类别繁多,因此其水解物也有类似特征。含蛋白质的原料在生物培养中被称为有机氮源,可实际上,有机氮源不仅仅提供氮元素,也是生物生长和产物分泌调控所需要的,如维生素等。另外在有机氮源中,还往往含大量的碳源。

        正因为有机氮源是培养基最重要的成分,而且结构复杂多样,质量难控,因此在使用有机氮源时,很有必要对其原料来源、加工过程、关键指标等进行认真分析,甚至要到生产现场进行考察,否则一旦原料出现问题,对于一个复杂的发酵体系,根据无法迅速锁定原因,容易造成巨大的经济损失。因此质量稳定是供需双方建立长久关系的基本保障。

        本文将从概念、原料、分类、成分、加工方法和分析方法等全方位概述蛋白胨,是一篇值得收藏长期阅读的文章。

        另外也正是由于蛋白胨成分复杂,也使得在每个微生物发酵中使用蛋白胨成为可能,即使不为大规模应用,也可能在研发中使用蛋白胨以获得关键影响因素或前体,为大幅度提高产量创造机会(该内容近期有文章介绍)。

        希望各位,也请推荐给需要的朋友,文中如果有错误,也希望各位同仁能够给出建议,谢谢。


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什么是蛋白胨?

蛋白胨,英文名称:peptone,是蛋白质分解产物,如将牛肉、酪蛋白、牛奶粉、白明胶、大豆蛋白、丝蛋白、血纤维蛋白等为原料,经不完全的水解工艺所得的产物。市售产品以淡黄至棕黄色粉剂为主。其分子量介于䏡和肽之间,约2000左右。

本概念最关键的用语:1是不完全水解,不完全是一个非定量的用语,所以,对于每家企业而言,蛋白质分解用酶及酶解的程度会不同,因此同样是蛋白胨,对于需要精确控制的生物过程,则并不具有通用性,需要通过试验验证可用性。酶本身的催化作用也不具有精确性,酶的水解活力还会受到酶本身及催化环境的影响。

本概念另一个关键用语是蛋白质:不同物种,甚至相同物种的不同部位,蛋白质的种类不同,因此其产物也复杂多变。

主要特点:影响多,成分复杂

蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。不同来源的蛋白质和不同的水解条件,其水解物中组成可千差万别,所以胨往往是一个复杂的多肽混合物。除了氨基酸外,蛋白胨中也包括其他多种成分,因此能为生物培养提供C源、N源、生长因子等营养物质。


一般来说,用于蛋白胨生产的蛋白包括动物来源、植物来源和微生物来源的蛋白。目前人造肉的研究已经成为热点,相信未来人造肉的副产物也可能成为蛋白胨的原料来源,该内容不在本文叙述的范围。

动物蛋白

主要包括:胰胨、肉胨、骨胨、蚕蛹蛋白胨、血液蛋白胨,鱼虾粉,牛奶粉等。下表4的数据可供参考。


知识扩展:猪骨为原料制备蛋白胨主要过程
1、原料:以猪头骨、三大骨为主。将配好的原料置于锅内,用40-50℃水冲洗一遍,然后加水,其比例为1:1.2。
2、高温萃取:加热加压至4kgf/cm2,保压平衡2h。
3、调节pH:取工业盐酸将肉汤的pH调到5.2。
4、消化:将汤温降至合适的温度,然后加入消化酶进行消化。
5、浓缩:将消化好的肉汤,用双层纱布过滤,然后将上清加热浓缩。
6、干燥:将浓缩好的稀膏状物,干燥,然后磨粉,分装。


流程图:新鲜骨头→粗碎→熬煮→去渣、去油→酶解→高温灭活→过滤→喷雾干燥→成品→理化检测→细菌培养。

植物性蛋白胨

以花生粕,大豆等作为原料生产的蛋白胨等是植物性蛋白胨。植物蛋白胨含糖量相对较高。


知识扩展:脱脂冷榨花生粕制备蛋白胨的过程:

准确称取脱脂冷榨花生粕5g 溶解于250 mL 去离子水中,用盐酸调pH 至2. 0,加入5% 的胃蛋白酶(以底物为基准,3 000 U/g)并于37 ℃搅拌条件下酶解200 min,定期监测其水解度变化;水解完成后,将水解液用NaOH 调节pH 至8. 0,加入2% 碱性蛋白酶(以底物为基准,50 000 U/g),于50 ℃搅拌条件下酶解190 min,定期监测DH% ;水解全部完成后将酶解液置于沸水浴中10 min 灭酶。冷却至室温后于4 ℃,5 000×g 离心25 min,取上清液冷冻干燥,即冷榨花生粕蛋白胨。

表3为冷榨花生粕蛋白胨的理化指标。

微生物蛋白胨

比如,酵母蛋白胨就属于微生物蛋白胨。基本制备过程可参考前一篇文章『详解酵母抽提物』。一般而言微生物菌体成分简单,蛋白含量高,所以更适合大规模应用,细菌蛋白胨总氮一般会超过14. 5% 

补充内容

重要指标

在使用任何一种原料之前,需要对原料的标准进行确认,这个过程需要将已经检测的原料标准与使用效果建立关联,然后从中筛选出关键影响指标。如果暂时无法确立关键影响指标,临时可以用摇瓶试验进行原料验收,但是这一标准往往与原料生产商提供的标准难以兼容,筛选有机氮源关键影响因素的方法,我们将在后期结合前体的筛选发文章一并讨论。

以下指标可供参考:

总氮含量

蛋白胨在微生物生长或产物合成中主要是作为提供氮源的营养基质,因此,含氮量是蛋白胨重要的质量评价指标。高质量细菌蛋白胨总氮要求达到14. 5% 以上,植物蛋白胨由于含糖量相对较高,其总氮应不低于8. 5%。总氮采取微量凯氏定氮法测定

氨基氮含量

氨基氮含量可反映出蛋白质的水解程度,分析氨基氮含量对蛋白胨质量评判非常重要。同一微生物在不同氨基氮含量的蛋白胨培养基上,其菌落大小和生长形态可能存在一定差异。作为试剂级蛋白胨,其质量标准要求其氨基氮≥2. 5%。氨基氮含量采取甲醛滴定法测定

糖含量

植物蛋白胨含糖量通常高于动物蛋白,不同动物蛋白胨含糖量也存在差异,如酪蛋白胨含糖量为(0. 64±0. 22)%、鸡羽毛蛋白胨为0. 76%、鱼蛋白胨为1. 33%。由于植物蛋白胨含糖量相对较高,不适合于配制糖发酵培养基。

糖含量采取苯酚硫酸法

亚硝酸盐

部分微生物在生长与发酵过程中可降低培养基pH,使亚硝酸盐和蛋白质分解产生的胺类物质生成亚硝胺,因此,蛋白胨中不应含有亚硝酸盐,否则,应用于食品时可能会影响安全。

亚硝酸盐法采取氨基苯磺酸⁃α⁃萘胺试液测定。

磷含量

磷元素是微生物进行生物大分子(如核酸和蛋白质)生物合成重要的营养基质,也是培养基重要的pH 缓冲物质。培养基中一般磷添加量为0. 005~0. 010 mol/L 较为适宜,磷含量过高对微生物生长不利,易造成富营养化,因此,应控制蛋白胨中磷含量。

磷含量采取比色法(测定波长820 nm)测定。

氯化钠含量

氯化钠是蛋白胨在中和过程中产生的主要盐类。当培养基中NaCl 浓度过高时,培养基渗透压通常也较高,不利于微生物生长。因此,应控制蛋白胨生产过程中的NaCl 含量。

氯化钠含量采取滴定法测定

灰分

蛋白胨灰分主要源自原料和生产工艺中使用的磷酸盐、硅酸盐、氯化钠等无机盐物质,灰分含量的高低与生产工艺和生产原料等有重要关系,如采取酸解法或碱解法制备蛋白胨时,其灰分通常比较高,可达到20%以上。通常情况下,灰分过高时,需对蛋白胨进行脱盐处理以降低灰分含量,蛋白胨酶法制备可有效解决灰分过高这一问题。作为生化试剂用蛋白胨通常要求灰分含量≤15. 0%。

灰分根据GB 5009. 4-2016 测定

水分含量测定

生化试剂用蛋白胨水分含量应低于5%,工业级蛋白胨对水分含量没有做具体要求。蛋白胨含水量过高时易吸潮、结联成块、颜色变深、变质以及易受到降解等,是一项关键控制指标,不仅影响产品外观性状,还影响微生物生长和代谢产物合成。一般情况下,蛋白胨标准品含水量为(3. 83±0. 13)%。

水分含量测定根据GB 5009. 3-2016 测定

维生素的含量

多数发酵工程师已经意识到了:国内外普遍存在培养基质量差异和批间质量不稳定的问题,这些批间差异往往与氮源的批间差异有直接关系,而前面的指标一般无法与生产效果有直接的对映关系,这是因为对于发酵,有机氮源中起关键作用的往往是维生素和游离氨基酸等因素。目前我国培养基质量标准体系建设较为落后,培养基原材料的系统研究较少。下表可直接反映了不同蛋白胨中维生素含量的巨大差异。

游离氨基酸组成含量

通过蛋白胨的定义可知,蛋白胨是蛋白的不完全水解物,因此成分远比20种氨基酸要复杂的多。但是微生物在吸收的有机氮源多数是游离氨基酸。因此游离氨基酸的比例和种类就成为蛋白胨的关键指标,也是质量的重要指标。

参考文献

1、满洋,陈舜胜,曲映红《南极磷虾副产物酶解蛋白胨工艺优化及实际应用》

2、肖怀秋,李玉珍,林亲录等《冷榨花生粕蛋白胨质量分析及其在枯草芽胞杆菌增殖中的应用》

3、姜莎,辛慧,莫日根等《超高效液相色谱-串联质谱法测定蛋白胨中9 种B族维生素》

4、黄菊,杨君丽,曾吉伟《酶法水解牛骨蛋白制备蛋白胨生化试剂的工艺》

未完待续


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