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保兴发酵罐:红霉素工业生产菌的种子罐培养条件优化

时间: 2019-03-06来源: 作者:

                       红霉素工业生产菌的种子罐培养条件优化

陈冲冲,杨 琪,储 炬*

(华东理工大学反应器工程国家重点实验室,上海 200237)

摘要:采用正交设计和响应面分析优化种子罐培养基配方,以菌体浓度、淀粉酶活力和黏度为指标,得到优化培养基配方:黄豆饼粉3.0%,硫酸铵0.15%,玉米浆0.57%,玉米淀粉1.81%,糊精2.37%,葡萄糖1.0%,豆油1.0%,氯化钠0.5%,碳酸钙0.4%,消泡剂0.02%。应用优化后的培养基进行15 L 种子罐发酵培养,获得了更高质量的种子。将该种子接种至50 L 发酵罐,红霉素A 的发酵产量由8 057 μg/ml 提高到8 563 μg/ml,提高了6.0%。关键词:红霉素;正交设计;响应面分析;发酵培养

红霉素( erythromycin,1) 是一种十四元环大环内酯类抗生素[1], 具有广谱抗菌作用, 临床广泛用于抑制革兰阳性菌, 其主要活性组分为红霉素A[2]。工业上,主要通过红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea) 发酵获得1。为了克服1 在酸性条件下易被降解的缺点,开发出了一系列衍生物,如克拉霉素(clarithromycin)、罗红霉素(roxithromycin) 和阿奇霉素(azithromycin) 等[3]。为了克服细菌耐药性问题,又开发出了新型1,如泰利霉素(telithromycin) 和喹红霉素(cethromycin)。随着新一代1 衍生物的大力开发,刺激了对原料药1 的需求[4]。

1 的工业生产一般采用多级发酵,每一级的发酵都会对下一级发酵造成影响,直至影响最终的发酵结果。因此,种子的质量控制是其中很重要的一

个环节。种子罐在移种时,若培养基过剩,会影响氧的传质,不利于菌体生长,还会造成通气量加大,转速提高,设备能耗增加,须优化种子罐的培养基

组成。本研究采用响应面法和正交试验法优化种子培养基配方[5],以降低培养基各组分含量并提高菌体浓度为主要目标,提高淀粉酶酶活力为次要目标,

以期获得交互影响最为显著的因素及最佳配比,改善菌体浓度和种子生理状态,提高1 的发酵水平。

1 仪器与材料

1.1 仪器与菌种

1.2 培养基

2 方法与结果

2.1 测定方法

发酵液效价及1 各组分的测定参考文献[ 6—7],采用离心压缩细胞体积法(PMV) 测定菌体浓度[8]。黏度测定:用20 ml 大肚移液管准确吸取发酵液,松开右手食指后,测量其流至吸管下端刻度线时所经过的时间,即为黏度值( 单位s)。

淀粉酶酶活力测定:采用淀粉酶试剂盒测定。其原理是淀粉分子和碘形成蓝色的络合物,在620 nm或630 nm 波长处测定已知淀粉浓度的空白管和样品管吸光度值之差,计算其酶活力( 式1)。c 样=N×1000×(D标-D样)/D标 式1式中,c 样- 样品浓度;N- 稀释倍数;D标- 拟标准液吸光度值;D样- 样品管吸光度值;1 000- 拟标准液浓度。

2.2 培养方法

2.2.1 种子斜面培养方法

用接种环从沙土管或新鲜斜面挑取少量孢子,在新鲜配制的干燥斜面上划线,34 ℃培养6 ~ 7 d。

2.2.2 摇瓶培养方法

采用500 ml 摇瓶,装液量10%,接种量8%。置敞开式摇床,33 ℃振荡(170 r/min) 培养48 h。

2.2.3 种子罐培养方法

15 L 种子罐装液量8 L,接种量10%,培养温度34 ℃,罐压0.05 MPa,过程控制溶氧在40%以上,培养48 h。

2.2.4 发酵罐培养方法

50 L 发酵罐装液量25 L,接种量5 L,过程控制培养温度33 ℃,罐压0.030 ~ 0.035 MPa,在线控制培养。

2.3 核酸法测定菌体浓度方法的建立

由于1 发酵采用复合培养基,培养基中的黄豆饼粉、淀粉等不溶性固形物较多,采用PMV 法检测菌体含量误差较大。而核酸在细胞中的含量十分稳定,且不受营养条件、菌龄等因素的影响,与生物量具有较好的线性关系[9]。根据核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环在λ=260 nm 处有最大吸收值,可采用UV 法测定核酸含量。已知1 μg/ml DNA 溶液的D260 为0.020,据此可计算溶液中的核酸含量。

2.3.1 发酵液体积与核酸含量的关系

测定同批发酵液、不同体积样品中的核酸含量,检测核酸法与菌体含量的相关性。分别取发酵罐中93 h 的发酵液( 菌体浓度52% )1.0、2.0、3.0和4.0 ml,加水洗涤2 次后,定容至10.0 ml。使用核酸定量仪检测发酵液中的核酸含量( n=3)。以发酵液体积(ml) 为横坐标(x),核酸含量(μg) 为纵坐标( y),进行线性回归,得回归方程y=43.92x-0.72(r2=0.998)。表明发酵液体积与核酸量呈正相关。

在同一样品中因菌体浓度恒定,据此推断菌体量与核酸量也呈正相关。

2.3.2 各培养基组分对核酸含量测定的影响

为了进一步确定培养基组分的核酸含量,分别称取糊精、玉米淀粉、黄豆饼粉和玉米浆各0.1 g,置10 ml 离心管,加水定容,离心,弃去上清液,再加水混匀,离心,弃去上清液。使用核酸定量仪检测发酵液中的核酸含量。



由表1 可知,培养基各组分对核酸含量的影响在可接受范围内,不影响使用核酸浓度来表征菌体浓度的准确度。

2.3.3 核酸法与PMV 法的比较

为了进一步验证核酸法的可靠性和稳定性,在发酵罐中进行了重复试验。由图1 可知,核酸浓度变化趋势与PMV 变化基本一致,说明可用核酸浓度表征菌体浓度变化。



2.4 摇瓶培养优化

在进行一级种子摇瓶发酵时,发现红色糖多孢菌属于高好氧菌,因此尝试用挡板摇瓶替代500 ml普通摇瓶( 装液量50 ml) 进行一级种子培养。保持接种量和其他培养条件一致,比较核酸浓度( 即菌体浓度) 和黏度的变化差异



2.5 培养基配方的优化[10]

2.5.1 6 因素3 水平正交试验

选取培养基主要组分:黄豆饼粉(A)、硫酸铵(B)、玉米浆(C)、玉米淀粉(D)、糊精(E) 和葡萄糖(F),分别取3 个水平,进行6 因子3 水平正交试验,见表2。



综上可知,影响核酸含量、淀粉酶酶活力和发酵液黏度的首要因素是黄豆饼粉,当黄豆饼粉含量为3.0%时,核酸含量(537.82 μg/ml)、淀粉酶酶活力(1 844.67 u/L) 均较高,而发酵液黏度(30.33 s)较低。试验以降低培养基浓度为目标,因此确定黄豆饼粉含量为3.0%。硫酸铵对淀粉酶酶活力的影响最小(R=7.42),当其含量为0.15%时,核酸含量(498 μg/ml) 较高且黏度(20.33 s) 较低,据此选择硫酸铵含量为0.15%。葡萄糖对核酸含量影响较小(R=1.77),当含量为1.0%时,淀粉酶酶活力较高(1 499.33 u/L),据此选择葡萄糖含量1.0%。玉米浆、玉米淀粉和糊精3 个因素对核酸含量和淀粉酶酶活力影响相对较小,因此后续着重对这3 个因素进行研究。

2.5.2 3 因素4 水平正交试验

进一步以核酸含量、淀粉酶酶活力和黏度为指标,其他因素含量不变的情况下,采用3 因素4 水平正交试验设计考察玉米淀粉(A)、糊精(B) 和玉米浆(C) 的最适配比,见表3。



2.5.3 响应面法优化玉米淀粉、糊精和玉米浆含量

以上述3 因素4 水平的正交优化结果为基础,对玉米淀粉(A)、糊精(B) 和玉米浆(C)3 因素进行进一步的响应面优化试验,采用中心组合设计(CCD),见表4。



方差分析结果表明, 回归模型失拟项P=0.936(>0.05),失拟不显著。模型相关系数R2 为0.990 7,AdjR2 为0.982 4,表明模型能够解释核酸变异度的98.24%,回归模型拟合效度好。由回归方程得到优化结果:玉米淀粉(% )=1.81,糊精(% )=2.37,玉米浆(% )=0.57,预测核酸含量响应最大值为604 μg/ml。由响应面分析三维图( 图3)可见,各因子之间交互作用较好,最佳预测点在试

验考察范围内,可以此二次多项式回归方程得到的最优发酵条件对优化结果进行验证。


2.6 验证试验

采用正交设计和响应面分析优化得到最佳配方为黄豆饼粉3.0%,硫酸铵0.15%,玉米浆0.57%,玉米淀粉1.81%,糊精2.37%,葡萄糖1.0%,豆油1.0%,氯化钠0.5%,碳酸钙0.4%,消泡剂0.02%。种子罐验证优化后培养基配方与原配方进行比较( 图4),可见优化后配方下种子罐菌体浓度增长速度、淀粉酶酶活力和发酵液黏度明显高于原配方。培养基优化后,菌丝生长更快,种子活力更强。



由表5 可知,工业生产菌经培养基优化后,在发酵罐培养工艺不做调整的情况下,发酵液的化学效价和红霉素A 组分含量均有所提高,其中重要组分红霉素A 浓度由8 057 μg/ml 增加至8 563 μg/ml,提高了6.0%。



3 讨论

采用正交设计和响应面分析优化得到最佳配方进行发酵罐验证,发现采用优化后的种子进行种子罐培养时菌体生长加快,发酵液黏度升高,淀粉酶酶活力提高,表明经过培养基优化后有效改善种子罐菌体的生长状况和种子质量,提高了1 的发酵单位,这也表明通过控制种子质量来提高发酵产物产量的方法可行。因种子的生理状态发生改变,后续发酵罐工艺也须进行相应的调整,以进一步提高1的产量。


作者简介:陈冲冲(1990—),男,硕士研究生,专业方向:工业微生物改造和培养优化。

Tel:15821184965

E-mail:chenchongw@outlook.com

通信联系人:储 炬(1963—),女,教授,从事发酵过程的调节、控制及菌种改良。

Tel:021-64253021

E-mail:juchu@ecust.edu.cn




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